MILE米乐人骨肉瘤细胞HOS培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人骨肉瘤细胞HOS

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：MEM+10%FBS+1%NEAA+1%P/S

传代方法：首次建议以1:2的比例进行传代。

备注：使用无菌离心管收集瓶内的培养基，保留用于过渡对比培养。如比较培养效果不理想，建议直接采用我们的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，培养至良好状态，灌满完全培养液并封好瓶口是确保细胞运输效果的最佳方法。收到细胞后，使用75%酒精喷洒消毒整个细胞瓶，放入超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，之后再进行处理。显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（建议拍摄40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片将作为重要的售后依据，若未提供照片则默认收到状态良好。传代后，建议一瓶用原瓶的完全培养基，另一瓶用自配的完全培养基进行对比培养，换液后应将瓶盖松开。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞未超过80%汇合度，收集培养瓶中的完全培养液至离心管中，留5ml完全培养基，置于37℃、5%CO2孵箱培养；如细胞密度超过80%，则可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台轻敲培养瓶，加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使之完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化并轻轻吹打使细胞脱落，转移悬液至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的MILE米乐无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如需将细胞转入液氮罐，请在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

注意，有些细胞贴壁不牢，运输过程中可能出现细胞脱落，属于正常现象。如脱落较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清以作为过渡培养（后期进行对比培养），沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，重悬，并消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）出现细胞问题可重发的情况：
(a) 细胞运输途中遇到问题（如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等），可重发；
(b) 细胞污染问题，请于收到产品48小时内提供真实实验结果，核实后重发；
(c) 常温发货的细胞静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内，若大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可重发；
(d) 干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时后并且未开封，若出现污染，可重发；
(e) 细胞活性问题，请于收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予以重发；
(f) 收到细胞当天及第2、第3天请拍照，3天未告知的视为产品合格。在4-7天内出现问题的，需提供收到细胞前3天的照片及出现问题时的照片和相关操作的详细步骤，与技术人员沟通后由其判定是否为我方责任的情况，可以重发。若技术人员认定为双方共同责任的，双方可协商解决或按合同价的50%收费重发。

2）出现细胞问题不予重发的情况：
(a) 客户造成的细胞污染，不予重发；
(b) 客户因不当操作导致细胞状态不佳，不予重发；
(c) 非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳，不予重发；
(d) 未提供细胞培养前3天照片的，不予重发；
(e) 细胞培养时经过其它处理的，不予重发；
(f) 收到细胞后2天内未告知的，不予重发；
(g) 具体情况另行决定。